Лайн блот что это
Лайн блот что это
Иммуноблот антифосфолипидных антител – иммунологическое исследование, позволяющее в одном лабораторном тесте провести анализ на несколько аутоантител, ассоциированных с развитием антифосфолипидного синдрома.
APS Immunoblotting, Antiphospholipid Antibodies Assay, Western Blot Analysis for the detection of Antiphospholipid Syndrome.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Антифосфолипидный синдром – аутоиммунное заболевание, клинически характеризующееся артериальными и венозными тромбозами, акушерской патологией (прежде всего – привычное невынашивание беременности в I и II триместрах и преждевременные роды), тромбоцитопенией и связанное с циркуляцией в крови антифисфолипидных антител.
Антифосфолипидные антитела не только являются лабораторным маркером АФС, но и играют ведущую роль в патогенезе его клинических проявлений. АФЛА обладают способностью воздействовать на процессы, составляющие основу регуляции системы свертывания крови, сдвигая равновесие в ней в сторону гиперкоагуляции – то есть тромбообразования. Процесс тромбообразования включает взаимодействие АФЛА с фосфолипидами мембран тромбоцитов, эндотелия (клеток, выстилающих изнутри кровеносные сосуды) и связанными с фосфолипидами плазменными белками. При АФС потенциально могут поражаться сосуды любого калибра – от капиллярного русла до крупных артерий, что обуславливает чрезвычайно разнообразный спектр клинических проявлений заболевания.
Антифосфолипидные антитела представляют собой семейство иммуноглобулинов разных классов (IgA, IgM и IgG), которые распознают определенные участки молекул фосфолипидов. Однако, согласно последним исследованиям, выяснилось, что главными мишенями АФЛА являются не сами фосфолипиды, а связывающиеся с ними белки плазмы, так называемые кофакторы. Комплекс кофактор-фосфолипид формирует новую молекулярную последовательность, к которой вырабатываются специфические антитела.
Таким образом, АФЛА реагируют с гетерогенной группой фосфолипидов и белковых антигенов плазмы крови, к которым относятся:
Повышенный риск развития инфаркта миокарда на фоне АФС был подтвержден после обнаружения в спектре АФЛА антител к окисленным липопротеинам низкой плотности, играющих ведущую роль в патогенезе атеросклероза.
Используемые в настоящее время диагностические критерии антифосфолипидного синдрома, принятые в 2006 году в Сиднее, помимо двух клинических параметров (тромбозы и акушерская патология), включают также три лабораторных признака – волчаночный антикоагулянт (определяется в фосфолипид-зависимых тестах на свертывание крови), а также антитела к кардиолипину и антитела к β2-гликопротеину I классов IgM и IgG, определяемые методом иммуноферментного анализа.
Антитела к кардиолипину являются основной фракцией АФЛА, их присутствие обычно ассоциировано с развитием тромбозов и тромбоцитопений. Выявление повышенного титра антител к кардиолипину на фоне клинической картины тромбозов является основанием для постановки диагноза «АФС».
Антитела к β2-гликопротеину I. β2-гликопротеин I – белок сыворотки, обладающий естественной антикоагулянтной активностью. Циркулирующие АФЛА распознают антигенные структуры, формирующиеся при взаимодействии β2-гликопротеина I и кардиолипина. Антитела к кардиолипину и β2-гликопротеину I чаще обнаруживаются у пациентов с первичной формой АФС, а в клинической картине у них преобладают тромбозы глубоких вен и эмболия легочной артерии.
Несмотря на высокую специфичность, применение для диагностики АФС только этих лабораторных критериев не всегда достаточно – тесты могут быть отрицательными при наличии клинических проявлений антифосфолипидного синдрома. Поэтому при наличии у пациента симптомов АФС и отрицательных результатах критериальных лабораторных параметров дополнительно используют определение антител к другим фосфолипидам) и кофакторным белкам.
Антитела к аннексину V. Роль аннексина V особенно важна для предотвращения тромбообразования в сосудах плаценты. Этот блок представлен во многих тканях, но в основном на эндотелиальных клетках и в плаценте. Аннексин V играет роль в предотвращении свертывания крови, конкурируя с протромбином (фактор свертывания крови) за связывание с фосфатидилсерином на оболочке клеток эндотелия и трофобласта. Молекулы аннексина V формируют блокирующий слой, и на поверхности трофобласта не происходит тромбообразования. У больных АФС антитела к этому белку вытесняют его с поверхности эндотелиоцитов и клеток трофобласта, что приводит к тромбозам сосудов плаценты и потере беременности. Антитела к аннексину V чаще выявляют при вторичном антифосфолипидном синдроме (возникающем на фоне других аутоиммунных заболеваний), соответственно, в клинической картине таких пациенток чаще встречается синдром привычного невынашивания беременности.
Антитела к тромбину – один из наиболее чувствительных тестов для диагностики антифосфолипидного синдрома. Наличие этих антител ассоциировано с развитием тромбоэмболических осложнений примерно в 70 % случаев – это самый высокий показатель среди всех маркеров АФС.
Для исследования широкого спектра антифосфолипидных антител используется метод иммунного блотинга. В его основе лежит иммунологическое взаимодействие антитела со специфичным антигеном. Выпускаемые производителем тест-системы для иммуноблота содержат нитроцеллюлозные полоски, на которых фиксированы антигены фосфолипидов и кофакторных белков. На полоску наносят исследуемую сыворотку, при наличии в ней АФЛА они связываются каждый со своим антигеном. Визуализацию образованных иммунных комплексов проводят путем добавления специального фермента и красителя. При наличии в сыворотке антифосфолипидных антител на полоске в зонах, соответствующих отдельным антигенам, появятся окрашенные полосы – так фиксируется положительный результат. Интенсивность окраски полосы можно дополнительно описывать количеством плюсов – это косвенно отражает концентрацию и аффинность (степень сродства) антител.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Что может влиять на результат?
Около 5 % здоровых людей имеют повышенный титр АФЛА, чаще это лица пожилого возраста – с возрастом процент АФЛА-позитивных людей, не страдающих АФС, увеличивается. Частота выявления антифосфолипидных антител увеличивается также у больных воспалительными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями (сифилис, ВИЧ-инфекция, вирусный гепатит С, герпес-вирусная инфекция), злокачественными новообразованиями, а также на фоне приема некоторых лекарственных препаратов (психотропные средства, оральные контрацептивы). Таким образом, любой из лабораторных признаков при отсутствии клинических симптомов не является достаточным условием для постановки диагноза «АФС».
Помимо первичного антифосфолипидного синдрома, существует также вторичный, возникающий на фоне других заболеваний соединительной ткани. При этом у некоторых пациентов появление признаков АФС может предшествовать появлению симптомов первичного соединительнотканного заболевания (системная красная волчанка, узелковый периартериит, системная склеродермия, ревматоидный артрит). Поэтому при обследовании пациентов с предполагаемым АФС в программу диагностики следует включать определение антинуклеарного фактора в качестве скринингового теста.
Кто назначает исследование?
Гематолог, ревматолог, акушер-гинеколог, ангиохирург, пульмонолог, терапевт, врач общей практики.
Иммуноблоттинг принцип метода
Иммуноблоттинг принцип метода
Иммуноблоттинг (от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА.
Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке.
При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом.
При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).
Радиоиммунный анализ (РИА)
В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.
РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л.
Контрольные вопросы
Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение.
Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии?
Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему?
Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать?
Как титруют комплемент?
Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК?
Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК?
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат?
Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией.
Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит?
Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции.
Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.
Иммуноблоттинг: что это?
Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией.
Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting).
Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.
Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.
Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов.
Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера).
В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 — 100 мкг белка на 1 см2.
Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК.
Кроме того, с помощью гибридизации по Саузерну можно легко выяснить, имеет ли целевой ген участок гидролиза определенной рестриктазой в своей внутренней части, что позволяет выбирать оптимальную стратегию клонирования изучаемого района генома.
По аналогичной схеме из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр можно перенести и молекулы РНК. Этот метод был назван Северным блоттингом (Northern blotting) в противоположность блоттингу по Саузерну (Southern blotting), так как фамилия Саузерн в английском языке означает «южный».
Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Западным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо переноситься на мембрану, если в транс-буфере присутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задержке крупных белков.
Мембрана ПВДФ оптимизирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшиеся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания.
Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низкомолекулярные белки также удерживаются эффективно. Благодаря высокой связывающей емкости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембраны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следовые количества белка в анализируемых смесях.
После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.
Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Staphylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-области иммуноглобулинов.
Детекцию образованных иммунных комплексов проводят химическим или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфатазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при использовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода.
В результате ферментативных реакций на мембране образуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело.
Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью водорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.
Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.
Реакция проводится в несколько этапов:
1.Вирус разрушают на компоненты — антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.
2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.
3. Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.
Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.
Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ — р24, gp41 и gp 120 (рис.37).
РИСУНКИ
 Рис.5. |
Рис.6. Капсулы К.рneumoniaе-светлые ореолы вокруг палочковидных бактерий.
Рис. 7. Техника посева на твердую питательную среду.СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология : учебник для студентов мед. вузов 2-е изд., испр. и доп. — 702 с. Под ред. А.А. Воробьева. М. : МИА, 2012.
2. Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям: учеб.пособие/(В.Б.Сбойчаков и др.); под ред. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапаца. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2014.- 320с.:ил.
3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед.
вузов — 760 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. СПб.: Спецлит, 2010.
4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс] : учебник: в 2 т. / Т. 1. — 448 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.
5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. — 480 с. Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М. : Гэотар Медиа, 2010.
Дополнительная литература
1. Иммунодиагностические реакции: учебное пособие / сост.: Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф.
Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 2016. — 86с.
2. Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Еnterobacter, Сitrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научное издание / Ю. З. Габидуллин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин – Уфа, 2015. – 250 с.
Дата добавления: 2014-10-15; Просмотров: 2804; Нарушение авторских прав?;
Главная » Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний
Иммуноблот: что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний
Что такое иммуноблот? Это распространенный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций человека. Он является одним из наиболее точных и надежных способов обнаружить наличие ВИЧ.
Для надежности он даже больше, чем энзим-соединенный assay иммуносорбента (elisa). Результаты иммуноблот считается неопровержимой и окончательной.Общая информация
Иммуноблот – что это? Для того, чтобы признать человека ВИЧ, вы должны пройти лабораторный метод исследования сыворотки крови на наличие антител.
Методом Вестерн-блот разделы также называется Вестерн-блот (вестерн блот). Он используется для обнаружения вирусных инфекций человека, в качестве дополнительного экспертного метода. Это необходимо для подтверждения ИФА – лабораторное исследование, позволяющее определить в крови наличие антител к ВИЧ. Иммуноблот перепроверить положительный ИФА.
Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.
Что такое иммуноблот? Эта методика лабораторных исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу.
В ходе специальных исследований общий вирусных белков в геле и на нитроцеллюлозные мембраны.
Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя)
Предназначен процедуру Вестерн-блот секций для определения ВИЧ-инфекции на разных стадиях. На первом этапе, очищенный вирус из составных частей подвергается электрофорезом и антигены, входящие в нее, деленной на молекулярный вес.
Вирус иммунодефицита человека размножается в живых клетках, внедренные в его генетической информации. На этой стадии, человек становится носителем вируса ВИЧ, если вы были инфицированы.
Специфика этого заболевания заключается в том, что он долгое время не проявляется. Вирус разрушает лимфоциты, таким образом, у человека снижается иммунитет и организм становится неспособным бороться с инфекциями.
Если ВИЧ-это правильно и своевременно лечить, пациент будет жить до глубокой старости. Отсутствие лечения неизбежно приводит к смерти. С момента инфекции, но без лечения, максимальный срок не более десяти лет.
Особенности
ОсобенностиАнализ иммуноблот-это надежный метод, который позволяет определить наличие антител к ВИЧ-антигенам первого и второго типа.
Если человек инфицирован, после двух недель антитела, которые могут быть обнаружены значительно позже. Особенностью ВИЧ является то, что количество антител быстро увеличивается и остается в крови пациента.
Даже если они присутствуют, болезнь может никак не проявляться в течение двух или более лет. Метод ИФА не всегда точно указывает на наличие болезни, требующая подтверждения результатов от-ПЦР и Вестерн-блот разделы, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.
Показания
ПоказанияЧто это за «иммуноблот» уже выяснили, но которые вводят в исследовании?
Поводом к проверке на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) иммуноблот станет положительным результатом ИФА. Нужно пройти через твердофазного иммуноферментного анализа у больных, которым предстоит операция.
Кроме того, вы должны сделать анализ планирующих беременность женщин, а также тех, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Вестерн-блот разделах назначают пациентам с ВИЧ-инфекцией, если результаты elisa являются сомнительными.
Поводом для обращения к врачу могут быть следующие тревожные симптомы:
быстрая потеря веса;слабость, потеря функции;расстройства кишечника (понос), которая длится три недели;обезвоживание;лихорадка;увеличение лимфатических узлов в организме;развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоз, обострение герпеса.
Пациенту не нужно готовиться перед сдачей венозной крови.
За 8-10 часов перед тестом не кушать. Не рекомендуется за день до сдачи крови употреблять алкоголь и кофейных напитков, тяжелых физических упражнений, испытывать волнение.
Где сделать анализ?
Где пройти тестирование на ВИЧ?
ИФА, иммуноблот анализа, проведенного в городских частных клиниках, результаты дают в течение дня. Возможна и срочная диагностика. В общественных учреждениях, медицинских тестов elisa и Вестерн-блот секции бесплатно, в соответствии с законодательством Российской Федерации.
Обязательную проверку на инфекционные заболевания беременных женщин, и больных, нуждающихся в госпитализации или хирургического вмешательства.Как проводится это исследование?
Как провести ИФА?
Иммуноблот положительный/отрицательный подтверждает или опровергает результаты elisa. Процедура достаточно простая. Специалист осуществляет забор венозной крови, по времени это занимает менее пяти минут.
После отбора пробы, место инъекции следует продезинфицировать и заклеить пластырем. Забор проводится натощак, поэтому после процедуры не помешает съесть плитку горького шоколада или сладкий горячий напиток.
Чтобы получить направление на бесплатный анализ в государственном медицинском учреждении, необходимо посетить терапевта.
В целом, иммуноблот не отличается от других исследований крови путем забора. Методология исследования проста. Если в крови человека присутствует вирус, организм для его уничтожения начинает вырабатывать антитела. Для каждого вируса существует множество белковых антигенов. Обнаружение этих антител является основой метода Вестерн-блот разделы. Стоимость
Сколько стоит анализ?
Иммуноблот ВИЧ относится к дешевым исследований.
В среднем, скрининговые методы иммуноанализа составляет от 500 до 900 рублей. Вестерн-блот разделов является изучение проверки, стоимость которых колеблется от трех до пяти тысяч рублей.
Более сложные методы намного дороже. Например, для анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.
Интерпретация результатов
Интерпретация результатовНаиболее распространенные методы диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ и иммуноблот.
Они это для определения в сыворотке антител к вирусу иммунодефицита человека. Инфекция обычно подтверждается двух тестов: скрининг и подтверждающий. Интерпретация результатов должна производиться врачом, он диагностирует и назначает лечение. Если иммуноблот положительный, это означает, что в человеческом организме вирус.
Положительный результат не должен стать поводом для самостоятельного лечения, поскольку каждый пациент может иметь свои собственные картины заболевания.
Качественный анализ включает в себя скрининг и сертификационный. Если у пациента не обнаруживается вирус, результат показывает «отрицательно». Когда обнаружен данный сертификат, скрининг проводят дополнительные исследования. Иммуноблот анализ, который подтверждает или опровергает скрининга. Если тест-полоски появляются в потемнение определенных областях (локализация белков), поставлен диагноз «ВИЧ».
Если результаты сомнительны, то испытания проводятся в течение трех месяцев.
Чтобы предотвратить заражение вирусом иммунодефицита человека возможно, если соблюдать определенные правила: избегать случайных половых контактов, использовать презервативы при контакте, не употребляю наркотики.
Если заболевание обнаружено у беременной женщины, важно следовать рекомендациям лечащего врача, не забывать о тесты на наличие вируса.
Что такое вестерн-блоттинг?
Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.
В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.
Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.
В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
После проведения ДСН — электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.
Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Механизм, компоненты, применение.
Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.
После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.
1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).
Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.
Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.
Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.
Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.
Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.
Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.
Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.
Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А — с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б — первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.
Протокол:
I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков
Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).
Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.
После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.
Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.
II. Электроперенос
Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.
Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте.
Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.