Лактоферрин в чем содержится больше всего
История выделения лактоферрина, производство и применение в продукции для человека
Производство Лактоферрина
Опытное производство лактоферрина было впервые освоено в Германии в 70-е годы XX века компанией Miley Gmbh совместно с мировым лидером — фирмой по производству пищевых ингредиентов и продуктов функционального питания «Моринага Милк Индастри» (Япония) в рамках комплексной переработки подсырной сыворотки.
В 1984 году в эксплуатацию был введен первый в мире завод по производству лактоферрина. На сегодняшний день в мире функционирует более 20 подобных заводов, выпускающих белок лактоферрина в сухой форме — это ФРГ, Голландия, Япония, Новая Зеландия, США, Австралия, Китай. Сырьевым источником для производства лактоферрина являются молоко и молочная сыворотка.
Производство Лактоферрина
Опытное производство лактоферрина было впервые освоено в Германии в 70-е годы XX века компанией Miley Gmbh совместно с мировым лидером — фирмой по производству пищевых ингредиентов и продуктов функционального питания «Моринага Милк Индастри» (Япония) в рамках комплексной переработки подсырной сыворотки.
В 1984 году в эксплуатацию был введен первый в мире завод по производству лактоферрина. На сегодняшний день в мире функционирует более 20 подобных заводов, выпускающих белок лактоферрина в сухой форме — это ФРГ, Голландия, Япония, Новая Зеландия, США, Австралия, Китай. Сырьевым источником для производства лактоферрина являются молоко и молочная сыворотка.
Спрос и производство
Растущий спрос на продукты здорового питания, в рецептуре которых используется лактоферрин, привел к росту объемов производства этого молочного белка. В 2001 году мировые объемы производства составляли 45,000 тн/год, в 2011 году уже 172,630 тн/год, в 2015 году около 221,810 тн/год к 2020 году ожидается 280,00 тн/год.
Основные производители лактоферрина в мире — Fonterra Group, Bega Cheese, FrieslandCampina (DMV), Milei Gmbh, Glanbia Nutritionals, Westland Milk, Tatura, Synlait Milk, WBC, Murray Goulburn, Ingredia Nutritional.
Основным потребителем этого продукта является Япония (60%), далее следует Южная Корея (12%) и Тайвань, где лактоферрин используется в производстве детского питания, БАД. В США и Европе лактоферрин используется в пищевой промышленности, в косметике и БАД.
Европа: Лактоферрин признан белком, безопасным для использования в продуктах питания и решением Европейской комиссии по пищевым добавкам №258/97 от 22.11.2012 (опубликовано в Official Journal of the European Union от 27.11.2012).
США: В 2005 году Организация по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами США (FDA) разрешило использование лактоферрина как «природного антибиотика» при разделке и хранении мясных продуктов.
Российская Федерация: Приложение 5а к СанПиН 2.3.2.1078-01, утвержденным Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 14 ноября 2001 г. N 36 БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА, КОМПОНЕНТЫ ПИЩИ И ПРОДУКТЫ, ЯВЛЯЮЩИЕСЯ ИХ ИСТОЧНИКАМИ, НЕ ОКАЗЫВАЮЩИЕ ВРЕДНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ.
Лактоферрин человека (источник материнское молоко, кровь или продукция генномодифицированных организмов, растений).
Нативная форма лактоферрина человека чЛФ (источник материнское молоко):
— выделяется многими научными лабораториями в мире в граммовых количествах,
В РФ был зарегистрирован лекарственный препарат «Лапрот», созданный в НИИ онкологии им. П.А.Герцена, г.Москва, активное вещество чЛФ, выделенный из молока человека. В настоящее время не производится.
Лактоферрин человека (источник материнское молоко, кровь или продукция генномодифицированных организмов, растений).
Нативная форма лактоферрина человека чЛФ (источник материнское молоко):
— выделяется многими научными лабораториями в мире в граммовых количествах,
В РФ был зарегистрирован лекарственный препарат «Лапрот», созданный в НИИ онкологии им. П.А.Герцена, г.Москва, активное вещество чЛФ, выделенный из молока человека. В настоящее время не производится.
Цель всех проектов – получение иньекционной формы лекарственного препарата на основе генноинженерного лактоферрина человека.
Во всех случаях белковая часть лактоферрина была идентична человеческому белку, тогда как гликозидная часть, которая составляет до 10-15% от общей массы природного белка, существенно отличается. Это не позволяет использовать такие белки для разработки инъекционных медицинских препаратов вследствие развития аллергии и риска анафилактического шока у пациента.
С другой стороны человеческий лактоферрин, полученный с использованием генноинженерных технологий применять наружно или перорально человеком экономически нецелесообразно.
Обзор Что такое лактоферрин и кто его производит
Что это такое?
Антимикробный и иммуномодулирующий белок лактоферрин вырабатывается с грудным молоком. Он входит в первую линию защиты организма от широкого спектра бактерий и вирусов. Лактоферрин защищает новорожденных от патогенной микрофлоры до тех пор, пока их собственного иммунитета не будет для этого достаточно, и способствует созреванию желудочно-кишечного тракта. Лактоферрин связывает железо и передается через различные рецепторы в клетки, сыворотку, желчь и спинномозговую жидкость и между ними.
С каждым годом ученые открывают все новые свойства лактоферрина. Считается, что он в разной степени защищает и является профилактикой анемии, язвы, листериоза, инфекций дыхательных путей, вируса герпеса, цитомегаловирусов, гепатита С, акне, остеопороза. Лактоферрин также помогает заживлять раны, стимулируя регенерацию соединительной ткани и клеток эпидермиса. Он работает как антибиотик, но в отличие от последнего не разрушает клетки организма, а убивает только патогенную флору.
Начиная с 1960-х годов, когда лактоферрин научились получать из коровьего и грудного молока, он начал вызывать повышенный интерес у ученых. Промышленное производство лактоферрина включает такие этапы, как выделение и очистка белка из обезжиренного молока, сырной сыворотки или сыворотки непосредственно из обезжиренного молока, полученной путем мембранной фильтрации. Лактоферрин получают методом ионообменной хроматографии и мембранной фильтрации. Концентрированный лактоферрин сушат в порошок при низкой температуре или на установках для распылительной сушки.
Жидкая сырная сыворотка
Готовый продукт добавляют в детские молочные смеси, напитки, продукты питания, средства гигиены, ветеринарные препараты и корма для животных.
Из-за широкого спектра применения рынок лактоферрина будет расти ежегодно до 2027 года на 7%, прогнозируют в Global Market Research. Так, только продукты для лечения акне, в числе которых входят препараты на основе лактоферрина, в США каждый год покупают до 50 млн человек, анемией же страдают 1,62 млрд людей на планете.
Производство лактоферрина. Источник: GEA
Применение
Лактоферрин от коронавируса
Одно из последних исследований утверждает, что продукты с лактоферрином защищают от коронавируса, что также говорит о потенциальном росте интереса потребителей к продуктам с данным ингредиентом.
Капсулы лактоферрина для защиты иммунитета предлагают несколько компаний на рынке. Jarrow Formula в США продает сухой лактоферрин в таблетках и заявляет, что продукт улучшает усвояемость железа и освобождает лактоферрин B, пептид, который повышает иммунитет и нормализует пищеварение.
JatCorp в Австралии продает капсулы лактоферрина из верблюжьего молока под брендом Auveno. В компании отмечают, что препарат благотворно влияет на иммунную систему и является пробиотиком. Британская OSKIA выпускает лактоферрин в капсулах из коровьего молока для нормализации уровня железа и здоровья кожи.
Лактоферрин для детей
Уже сейчас многие крупные игроки рынка предлагают смеси с лактоферрином. Американский производитель Enfamil заявляет, что выпущенная им смесь наиболее близка по составу к грудному молоку и является единственным продуктом на рынке с лактоферрином и мембранами жировых глобул молока. Такое сочетание ингредиентов улучшает пищеварение младенцев.
Лактоферрин в спортивном питании
Исследования доказали, что лактоферрин способствует снижению веса и ускоряет восстановительные процессы. Несколько ученых отметили пользу лактоферрина для пищеварения, так как ингредиент способствует росту клеток кишечника. Такая совокупность факторов сделала лактоферрин особенно популярным среди производителей спортивного питания.
Австралийская компания Farmers Beta A2 предлагает функциональный напиток с лактоферрином для спортсменов. В продукте, помимо лактоферрина, содержится сывороточный протеин, пребиотики и колострум. Производители заявляют, что продукт способствует восстановлению и развитию мышц, улучшает пищеварение и работу иммунной системы, подходит для детей и взрослых.
Разработчиков спортивного питания часто обвиняют, что классические продукты линейки вызывают расстройства кишечника, в том числе диарею. Morinaga Milk Industry провела исследования своего лактоферрина и установила, что у контрольной группы, употреблявшей продукты на основе ингредиента в течение времени эксперимента, было меньше эпизодов диареи, тошноты и усталости, чем у тех, кто получал плацебо.
Лактоферрин в косметике
Итальянская AG Pharma предлагает крем с 4% содержанием лактоферрина для защиты кожи от бактерий и паразитов.
Альтернативы лактоферрину
Как и в классической молочной отрасли, покупатели ищут на рынке не только продукты с лактоферрином на основе коровьего молока, но и его растительные аналоги. Популярность растительных продуктов особенно заметна среди молодого поколения. В 2020 году рынок лактоферрина на основе риса GMI оценила в 105 млн евро.
Исследователи отмечают, что лактоферрин из риса получить намного проще и дешевле, чем из коровьего молока. Кроме того, рис является крайне распотраненной сельхозкультурой, особенно в странах Азии. Это делает данный сегмент рынка потенциально перспективным, указали в GMI.
Лактоферрин в России
В России на данный момент лактоферрин не выпускают. Эксперты объясняют это сложностью производства и неразвитостью рынка. По словам генерального директора Streda Consulting Алексея Груздева, рынок глубокой переработки молока на ингредиенты в России на сегодня фактически отсутствует.
— Для России этот вопрос ровно такой же, как и с другими продуктами глубокой переработки. Во-первых, чтобы получить адекватные объемы конечного продукта, нужно переработать огромное количество молока. Процентное содержание этого белка в литре молоке очень маленькое. Второй вопрос, что делать с остальными составляющими молока после того, как получили лактоферрин. Соответственно, нужно налаживать полноценную глубокую переработку молока на компоненты. Нужен адекватный опыт в области глубокой переработки, а в России таких компаний нет. Сейчас у нас есть только переработка сыворотки, глубокой переработки молока на ингредиенты у нас нет в принципе.
С этим согласна и руководитель проектов «НЭО Центр» Екатерина Михалева. На сегодняшний момент весь лактоферрин, представленный в России, идет из-за рубежа.
— Импорт лактоферрина представлен в основном в составе БАД, направленных на борьбу с железодефицитом («Фибраксин» — источник арабиногалактана, дополнительного источника железа, способствует нормализации функции кишечника). В незначительных объемах лактоферрин представлен как компонент в составе химических продуктов, используемых для производства косметической продукции. Всего объем импорта продуктов (БАД и химических компонентов) составил в 2020 г. 43 млн руб.
Отсутствие технологий, высокие затраты на их разработку, получение патентов, государственные стандарты и нормы являются факторами, сдерживающими рост рынка, поясняет Елена Михалева.
Также рекомендуем:
© Информационное агентство «Milknews» (2015-2019). Свидетельство о регистрации СМИ от 5 марта 2015г. ИА № ФC 77-60961, выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
107078, г. Москва, Докучаев пер., дом 6, стр. 2
Тел. +7 (495) 114-51-29
E-mail:info@milknews.ru
Все права на любые материалы, опубликованные на сайте, защищены в соответствии с российским и международным законодательством об интеллектуальной собственности. Правообладатель допускает частичное цитирование информации и информационных материалов, в объеме, не превышающем 30%, с обязательным указанием имени автора (при наличии), наименования правообладателя (ИА «Milknews») и гиперссылки на источник заимствования. Без письменного разрешения правообладателя не допускается копирование и последующее распространение размещенных на сайте материалов в полном объеме.
Лактоферрин в чем содержится больше всего
Биологически активный белок лактоферрин привлекает исследователей всего мира уже более 70 лет. Он принадлежит к семейству белков-трансферринов, осуществляющих перенос железа в клетки и контролирующих уровень свободного железа в крови и во внешних секретах. Лактоферрин представлен преимущественно в молоке человека и других млекопитающих.
Лактоферрин обладает перспективными в биофармацевтическом отношении свойствами: антибактериальными, антивирусными, противогрибковыми, противопаразитическими, антиканцерными, противовоспалительными, иммуномодуляционными, антиоксидантными и регенеративными. Данный белок востребован при производстве биологически активных добавок, детского питания, фармацевтической и парфюмерно-косметической продукции и др.
Мировая потребность в лактоферрине сегодня (90 т) значительно превышает предложение. Лактоферрин продолжает оставаться в ряду дорогостоящих белков. На данный момент один грамм лактоферрина человека стоит около 15000 долларов, поэтому вопрос об удешевлении и увеличении его производства стоит очень остро.
Российский рынок представлен импортными препаратами высокоочищенного лактоферрина крупного рогатого скота. Процедура его выделения из коровьего молока является трудоемкой. Кроме того, он не идентичен человеческому лактоферрину.
Использование донорского женского молока в качестве источника лактоферрина во многих странах ограничено, а в Российской Федерации запрещено в связи с возможностью вирусной контаминации (СПИД, гепатит).
Таким образом, получение рекомбинантного аналога лактоферрина человека, аутентичного природному белку в препаративных количествах, является актуальной задачей. Предпринимались неоднократные попытки по использованию различных систем для получения рекомбинантного лактоферрина: Aspergillus niger, трансгенная соя, рис, и др. Тем не менее такие проблемы, как низкий уровень экспрессии белка, высокая стоимость, низкая биодоступность, а также сложные процедуры очистки по-прежнему не снимают актуальности проблемы поиска оптимального метода производства генно-инженерного лактоферрина в производственных масштабах.
Цель работы – анализ известных методов получения рекомбинантного лактоферрина и разработка способа получения аналога лактоферрина человека, аутентичного природному белку путем микробного синтеза.
Обзор известных способов получения рекомбинантного лактоферрина
Продукцию рекомбинантного лактоферрина человека производят при использовании эукариотических клеточных систем. Все исследования в данной области направлены на создание высокотехнологичной и низкозатратной системы продукции рекомбинантного лактоферрина, обладающего всем спектром физико-химических и биологических свойств, присущих природному белку [9].
В некоторых странах (США, Япония) развернут широкий фронт исследований по получению рекомбинантного лактоферрина человека в микроскопических грибах (Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae), растениях (табак, картофель, рис). В Южной Корее и Голландии предпринимаются попытки организовать в промышленных масштабах выпуск рекомбинантного лактоферрина человека, выделенного из молока трансгенных коров, в Белоруссии – из молока трансгенных коз, в России – из куриных яиц [1–2, 10]. Основные организмы-биореакторы, используемые для получения рекомбинантного лактоферрина человека, представлены в табл. 1.
Основные организмы-биореакторы, используемые для получения рекомбинантного лактоферрина человека
Трудоемкость и длительность процесса получения трансгенных организмов.
Сложность при очистке молока.
Снижение биологической активности за счет отсутствия адекватных механизмов внесения специфических пострансляционных модификаций в организмах-продуцентах
Сложность получения трансгенных яиц, низкий выход
На сегодняшний день в продаже имеется лактоферрин человека, полученный при помощи грибков рода Aspergillus [7], а также из риса. Компания Agennix (США) выполнила исследования рекомбинантного лактоферрина человека из Aspergillus awamori. Но биологическая доступность препарата составила менее 0,5 %. Вследствие отличий в механизмах пострансляционной модификации в клетках низших и высших эукариот белок, полученный из Aspergillus, структурно и функционально отличается от природного. Более того, использование грибов Aspergillus для продукции рекомбинантных белков связано с высоким риском загрязнения афлатоксинами, являющиеся потенциальными канцерогенами [3].
В США, Японии, Китае проводятся эксперименты по получению лактоферрина из трансгенных растений риса, табака (Nicotiana tabacum), картофеля [14–16]. Получение таких растений основано на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Конкретно, эта часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных конструкций, включающих целевой ген [10, 17].
Способ получения целевого белка включает следующие стадии: 1) построения вектора, содержащего промоутер и ген лактоферрина, 2) введение вектора в Agrobacterium, 3) преобразования Agrobacterium в растительную клетку и 4) массовое производство белка-лактоферрина с использованием трансформированных клеток растений [20].
Хотя мысль внедрения гена лактоферрина в растительный геном для выработки белка в растении представляется перспективной, этот подход не лишен недостатков. Среди них необходимо отметить низкий уровень экспрессии лактоферрина, даже при использовании сильных промоторов; перегруженность углеводным компонентом, к тому же при получении трансгенных растений в сельскохозяйственных масштабах существует опасность утечки трансгена в окружающую среду в результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами (ауткроссинг) [2, 6].
Среди биоректоров на основе клеток позвоночных можно выделить три типа: культура клеток, соматический трансгеноз и генетический трансгеноз. В качестве генетического трансгеноза используют различные классы позвоночных, главным образом, птиц и млекопитающих. Клетки птиц, в отличие от клеток млекопитающих, обладают тем преимуществом, что они не содержат в своем составе вирусов, патогенных для человека, а также прионов, вследствие чего могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. Однако производство белков в культуре клеток птиц в настоящее время используется ограниченно, что связано с проблемами доставки генетического материала.
Культуры клеток растений и млекопитающих для продукции рекомбинантного лактоферрина характеризуются недостаточным уровнем экспрессии гена для последующей очистки продукта и разработки производственной технологии.
Особый интерес представляют работы, посвященные продукции рекомбинантного лактоферрина человека в клетках молочной железы животных-биореакторов (мышей, коз, кроликов и коров) и его секреции в молоко. С крупными животными работают специалисты в Голландии и Китае. Голландские учёные получили трансгенную корову с человеческим лактоферрином в молоке восемь лет назад [18]. Но им удалось добиться концентрации всего 2,8 г/л, причем у последующих поколений животных процент лактоферрина заметно снижался. Дальше научных разработок проект не продвинулся. В Китае у трансгенных коз удалось получить всего 0,7 г/л молока этого уникального белка. Выведением трансгенных коз занимаются также и в Калифорнии [2, 12].
В Финляндии пытались получить трансгенных коров. Но попытка обернулась неудачей, поскольку коровы-биореакторы поголовно страдали маститом. В Эдинбурге, в Рослинском институте, где вывели овцу Долли, разводят также генетически модифицированных кур [3, 13].
Наибольшие успехи в данной технологии удалось достичь белорусским и российским ученым, объединившим свои усилия в рамках проекта «БелРосТрансген». Были созданы первые опытные стада коз, которые продуцируют с молоком бактерицидный белок человека – лактоферрин [17].
Стратегия создания сельскохозяйственных молочных животных в качестве биореакторов основана на введении в геном животных генетических конструкций, содержащих последовательности генов человека, кодирующих биологически активные белки, и управляемых регуляторными элементами одного из «генов молока» коровы или козы [6].
Фрагмент ДНК человека вводят в оплодотворенную яйцеклетку до слияний мужского и женского ядер. После слияния ядер клетку помещают в инкубатор. После начала деления оплодотворенную яйцеклетку пересаживают в другой организм – козу, которая как живой инкубатор выносит плод [8].
Согласно этой стратегии трансгенные животные способны синтезировать на высоком уровне белок человека исключительно в молочной железе и секретировать его в молоко, которое, в свою очередь, становится источником для выделения белка человека.
Такие системы характеризуются высоким выходом целевого продукта, а полученный таким образом рекомбинантный лактоферрин – аутентичностью природному белку. Однако получение рекомбинантного лактоферрина в клетках молочной железы животных-биореакторах in vivo является дорогостоящим процессом, требующим высоких затрат на содержание (особенно в России при среднегодовой температуре ниже нуля), труда и времени, также есть возможность инфицирования продукта прионами и вредного воздействия препаратов на самих животных и др. [2, 5].
Группой российских ученых сотрудников НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН совместно с учёными Московского научно-исследовательского онкологического института им. П. А. Герцена была создана и протестирована новая система для эффективного производства человеческого лактоферрина в куриных яйцах [19]. Разработанная система основана на введении гена лактоферрина в оплодотворённые куриные яйца с помощью частиц аденовируса CELO. Это широко распространённый вирус, не вызывающий у взрослых птиц серьёзных заболеваний. В случае заражения этим вирусом оплодотворённых яиц в них могут накапливаться значительные количества вирусных белков. Уровень содержания человеческого лактоферрина достигал всего 0,8 мг на яйцо [9, 12].
Аденовирусный вектор, несущий в составе генома ген лактоферрина человека, вводят в аллантоис 9–10-дневного куриного эмбриона. Последующее культивирование осуществляют путем инкубации яйца при температуре 37 °C в течение 70–75 часов. Затем выделяют рекомбинантный белок из аллантоисной жидкости куриного эмбриона [11]. Недостатками данной системы являются низкий выход белка и необходимость высокого контроля качества очистки.
Также известны патенты на способы получения лактоферрина человека с помощью: клубники (Патент №WO090184, 2003), кукурузы (Maize), насекомых (Spodoptera frugiperda, Bombyx mori (Патент №WO030517, 1999), Candida (Патент №WO047203, 1999), Saccharomyces cerevisiae и др., однако значительных результатов с помощью данных систем достичь не удалось.
Представляется перспективным использование в качестве продуцента рекомбинантного лактоферрина штамма E. coli в виду хорошо изученной генетики данного микроорганизма, доступности удобных экспрессионных векторных систем и штаммов хозяина, простоты в использовании, низкой стоимости.
При получении рекомбинантного лактоферина с использованием бактериальных культур могут быть реализованы три вида экспрессии гена ltf : цитоплазматическая, периплазматическая и экстраклеточная (рис. 1).
Цитоплазматическая экспрессия предполагает осуществление следующих стадий: клонирование и экспрессия изучаемого гена, выделение и очистка телец включения, солюбилизация агрегированного белка, рефолдинг растворенного белка, получение биологически активного белка. Такой подход имеет ряд преимуществ: высокий выход белка, легкость отделения телец включения от растворимых телец включения, низкая степень деградации белков. Однако у цитоплазматической экспрессии имеются недостатки: отсутствие у белков биологической активности, многостадийный процесс получения биологически активного белка.
Периплазматическая экспрессия включает стадии: конструирование оптимальной для экспрессии в бактериях мРНК, конструирование вектора, клонирование и экспрессия изучаемого гена, выделение из периплазматического пространства и очистка белка, получение белка в биологически активном состоянии. Периплазматической экспрессии присущи достоинства и недостатки. Достоинства метода включают эффективное концентрирование белка, что облегчает дальнейшую очистку; правильное сворачивание белка благодаря окислительному потенциалу плазмы и тиолсульфидным изомеразам. Недостатки метода: сложность и недостаточная изученность транспорта белка в периплазматическое пространство, образование телец включения вследствие высокого содержания дисульфидных связей.
Рис. 1. Схема клонирования гена ltf
Экстраклеточная экспрессия может быть реализована двумя путями. I путь: конструирование оптимальной для экспрессии в бактериях мРНК, конструирование вектора с сигнальным пептидом, клонирование и экспрессия изучаемого гена, индуцирование пермеабилизации внешней мембраны, выделение белка из культуральной среды, получение биологически активного белка. II путь: конструирование оптимальной для экспрессии в бактериях мРНК с С-концевым гемолизином, конструирование вектора, клонирование и экспрессия изучаемого гена, выделение белка из культуральной среды, получение биологически активного белка.
Результаты собственных исследований
На основании проведенного обзора отечественных и зарубежных источников по получению рекомбинантного лактоферрина человека определена цель экспериментальных исследований – разработка способа получения лактоферрина человека с помощью штаммов, осуществляющих его продукцию в цитоплазме и периплазме клеток, а также оптимизация условий культивирования, обеспечивающих получение белка в растворимой форме.
В ходе проведенных исследований синтезирована мРНК лактоферрина человека, исходя из последовательности базы данных GenBank таким образом, чтобы непосредственно за кодирующей последовательностью был расположен участок, соответствующий гексагистидиновой последовательности. В результате индуцируемой экспрессии клонированного гена будет синтезироваться лактоферрин, содержащий дополнительную гексагистидиновую последовательность в С-концевой области полипептидной цепи, позволяющую осуществлять последующую аффинную чистку белка на Ni-NTA-агарозе.
Сконструированы плазмиды рТАС, рТ7 и вектор рЕТ28а+, модифицированный сигнальной последовательностью OmpA, обеспечивающей транспорт белков через внутреннюю мембрану в периплазму, содержащие в своем составе (кДНК) мРНК лактоферрина человека. Полученными плазмидами трансформированы клетки штамма E. coli BL21DE3. Затем исследовалась экспрессия лактоферрина в клетках, трансформированных плазмидами мрЕТ28а+, рТ7 и рТАС при различных температурах (37°С, 23°С, 15°С) с целью выбора оптимального режима. Концентрацию лактоферрина определяли в культуральной среде после разрушения клеток и в растворенных тельцах включения.
В результате экспериментальных исследований установлено, что экспрессия лактоферрина происходит при всех исследуемых температурах и используемых видах продукции (цитоплазма / периплазма клеток). Наибольший синтез белка наблюдается при 37 ºС. Максимальные выходы гибридного белка в растворимой форме достигаются в результате культивирования рекомбинантного штамма при 23 °С. При более высоких (37 ºС) и низких (15 ºС) температурах белок, напротив, накапливается преимущественно в тельцах включения.
Наиболее продуктивным в отношения синтеза лактоферрина является штамм E. сoli BL21DE3 / pT7, осуществляющий продукцию белка в цитоплазме клеток.
Проведен обзор известных эукариотических и бактериальных клеточных систем, используемых для получения рекомбинантного лактоферрина, максимально приближенного к лактоферрину человека. Выявлены достоинства и недостатки известных генно-инженерных способов получения лактоферрина человека. Выбран перспективный штамм – продуцент рекомбинантного лактоферрина человека. Предложена схема клонирования гена ltf с реализацией трех вариантов продукции целевого белка: цитоплазматической, периплазматической и экстраклеточной экспрессии.
Проведены собственные исследования по получению рекомбинантного лактоферрина человека с использованием в качестве источника белка штамма E. сoli и сконструированных плазмид мрЕТ28а+, рТ7 и рТАС. Показана экспрессия лактоферрина при всех исследуемых температурных режимах и используемых видах секреции (цитоплазматической / периплазматической). Установлено, что максимальный выход белка наблюдается при температуре культивирования рекомбинантного штамма E. сoli 37 ºС, максимальный выход растворимой формы лактоферрина характерен для температуры 23 °С. Выявлено, что при 37 ºС и 15 ºС рекомбинантный белок накапливается преимущественно в тельцах включения. Определен наиболее продуктивный штамм E. сoli BL21DE3 / pT7, осуществляющий продукцию лактоферрина в цитоплазме клеток.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы, соглашение на предоставление гранта №14.В37.21.1232 от 14.09.2012 г.
Рецензенты:
Ульрих Е. В., д.т.н., профессор, профессор ФГБОУ ВПО «Кузбасский государственный технический университет им. Т. Ф. Горбачева», г.Кемерово.
Просеков А. Ю., д.т.н., профессор, заведующий кафедрой «Бионанотехнология» ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», г.Кемерово.