Лизис клеток что это
Лизис
Смотреть что такое «Лизис» в других словарях:
лизис — ослабление, растворение, распад, понижение Словарь русских синонимов. лизис сущ., кол во синонимов: 5 • зонулолиз (2) • … Словарь синонимов
ЛИЗИС — (от греч. lysis разложение распад), постепенное разрешение болезни: медленное понижение высокой температуры тела и угасание других симптомов. Ср. Кризис … Большой Энциклопедический словарь
ЛИЗИС — растворение, разрушение клеток, в т. ч. микроорганизмов, под влиянием различных агентов, напр., ферментов, бактериолизинов, бактериофагов, антибиотиков … Большой Энциклопедический словарь
ЛИЗИС — ЛИЗИС, разрушение КЛЕТКИ. Живая клетка может быть разрушена, когда ее внешняя стенка растворяется под воздействием лизосом или когда она поглощается ФАГОЦИТАМИ в процессе фагоцитоза, что является нормальной реакцией на обезвреживание клеток… … Научно-технический энциклопедический словарь
ЛИЗИС — ЛИЗИС, лизиса, муж. (греч. lysis развязывание, освобождение от чего нибудь) (мед.). Период постепенного и медленного падения температуры при инфекционных заболеваниях; ант. кризис. Толковый словарь Ушакова. Д.Н. Ушаков. 1935 1940 … Толковый словарь Ушакова
ЛИЗИС — (от греч. lysis разложение, распад, растворение), разрушение и растворение клеток, в т. ч. микроорганизмов под действием ферментов, содержащихся в лизосомах (см. АВТОЛИЗ), или др. агентов, обладающих растворяющим (литическим) действием.… … Биологический энциклопедический словарь
лизис — разрушение и растворение клеток, в том числе и микроорганизмов, под действием ферментов или др. агентов. См. также лизаты. (Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.) … Словарь микробиологии
Лизис — (от греч. lysis растворение) способность бакгерий распадаться путем автолиза под действием собственных ферментов или фаголиза (при заражении бактериофагом). Вероятно, играет значительную роль в редукции биомассы микроорганизмов. Экологический… … Экологический словарь
ЛИЗИС — ЛИЗИС, lysis (от греч. 1уо разрешаю), одна из форм третьего периода лихорадки (stadii decrementi), спадения ее. Л. характе температур! з»а,5° | i 38,5° 37,5° i п 36,5° / 1 » темпе ратур! 40° 39,5° у 38,5″ у… … Большая медицинская энциклопедия
лизис — Разрушение клеточной мембраны [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN lysis … Справочник технического переводчика
Лизис — * лізіс * lysis разрушение и растворение под действием ферментов, содержащихся в лизосомах и выделяемых инфицирующими вирусными частицами, клеток хозяина, при котором в среду высвобождается новое потомство вируса … Генетика. Энциклопедический словарь
Клеточный лизис
Клеточный лизис * клетачны лізіс * cell lysis — разрушение клеточной мембраны, приводящее к растворению клетки и попаданию ее компонентов в окружающую среду. Напр., у бактерий — бактериолизис, у красных кровяных клеток — гемолизис.
Смотреть что такое «Клеточный лизис» в других словарях:
Инфаркт миокарда — I Инфаркт миокарда Инфаркт миокарда острое заболевание, обусловленное развитием очага или очагов ишемического некроза в сердечной мышце, проявляющееся в большинстве случаев характерной болью, нарушением сократительной и других функций сердца,… … Медицинская энциклопедия
Бактериофаги — Структура типичного миовируса бактериофага. Бактериофаги (фаги) (от др. греч … Википедия
Иммунитет — I Иммунитет (лат. immunitas освобождение, избавление от чего либо) невосприимчивость организма к различным инфекционным агентам (вирусам, бактериям, грибкам, простейшим, гельминтам) и продуктам их жизнедеятельности, а также к тканям и веществам… … Медицинская энциклопедия
Фаг — Бактериофаги (фаги) (от греч. φάγος пожирать) вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего, бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического… … Википедия
Фаги — Бактериофаги (фаги) (от греч. φάγος пожирать) вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего, бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического… … Википедия
Лимфоциты — мононуклеарные клетки крови, лимфатических узлов и тканей, к рые вместе с макрофагами обусловливают иммунный ответ (см.) животного организма, включая человека. Это сферические клетки диаметром 8 15 мкм. Имеют круглое, неразделенное на сегменты,… … Словарь микробиологии
Иммунитет (биол.) — Иммунитет (от лат. immunitas освобождение, избавление от чего либо), невосприимчивость организма к инфекционным агентам и чужеродным веществам антигенной природы, несущим чужеродную генетическую информацию. Наиболее частым проявлением И. является … Большая советская энциклопедия
Иммунитет — I Иммунитет (от лат. immunitas освобождение, избавление от чего либо) невосприимчивость организма к инфекционным агентам и чужеродным веществам антигенной природы, несущим чужеродную генетическую информацию. Наиболее частым проявлением И … Большая советская энциклопедия
Клубеньковые бактерии бобовых — Данные палеонтологии свидетельствуют о том, что самыми древними бобовыми культурами, имевшими клубеньки, были некоторые растения, принадлежащие к группе Eucaesalpinioideae. У современных видов бобовых растений клубеньки обнаружены … Биологическая энциклопедия
Клетка — I Клетка (cytus) основная структурно функциональная единица, определяющая строение, жизнедеятельность, развитие и размножение животных и растительных организмов за исключением вирусов; элементарная живая система, способная к обмену веществ с… … Медицинская энциклопедия
ЛИЗИС
Смотреть что такое ЛИЗИС в других словарях:
ЛИЗИС
(Λύσις) — пифагореец из Тарента, современник Архиты, жил в Фивах и был учителем Эпаминонда.
ЛИЗИС
(от греч. lýsis — растворение, распад, ослабление, развязка) 1) медленное и постепенное (в противоположность Кризису) падение температуры тела п. смотреть
ЛИЗИС
лизис м. 1) Медленное падение высокой температуры с постепенным ослаблением явлений болезни при лихорадочных заболеваниях (в медицине). 2) Растворение клеток, разрушение клеточной структуры тканей под действием ферментов, кислот, щелочей, солей, антибиотиков и т.п. (в биологии).
ЛИЗИС
ЛИЗИС
ЛИЗИС
Лизис (Λύσις) — пифагореец из Тарента, современник Архиты, жил в Фивах и был учителем Эпаминонда.
ЛИЗИС
ли́зис (гр. lysis растворение) 1) мед. медленное, в противоположность кризису, ослабление проявлений болезни, сопровождающееся постепенным понижением. смотреть
ЛИЗИС
ЛИЗИС
ЛИЗИС (от греч. lysis — разложение, распад, растворение), разрушение и растворение клеток, в т. ч. микроорганизмов под действием ферментов, содержащих. смотреть
ЛИЗИС
1) Орфографическая запись слова: лизис2) Ударение в слове: л`изис3) Деление слова на слоги (перенос слова): лизис4) Фонетическая транскрипция слова лиз. смотреть
ЛИЗИС
ЛИЗИС
лизис разрушение и растворение клеток, в том числе и микроорганизмов, под действием ферментов или др. агентов. См. также лизаты. (Источник: «Микробиол. смотреть
Лизаты: тренажер для иммунитета
Обзор свойств и показаний разных бактериальных лизатов — грамотная консультация, исходя из запроса покупателя
Они появились в наших аптеках всего два десятилетия назад, но быстро заняли свою нишу и приобрели известность у врачей и пациентов. Безрецептурные представители этой группы могут стать прекрасным инструментом, расширяющим возможности фармконсультации и позволяющим эффективно помочь клиенту аптеки. Сегодня, когда эпидемиологический сезон в разгаре, самое время освежить знания о безрецептурных бактериальных лизатах, их сво йствах и показаниях.
Что это такое
Лизатом (от греческого «лизис» — «разложение») называют суспензию, которая образуется вследствие разрушения бактериальных клеток. Она включает частицы бактериофагов и обломки стенок микроорганизмов, которые не обладают патогенностью и, соответственно, не представляют инфекционного риска для организма.
У «обломков» сохраняется специфическая структура и рецепторы, которые распознаются иммунной системой как враждебные. При этом организм концентрирует защитные силы, чтобы противостоять «натиску». В результате формируется селективный иммунный ответ против штаммов бактерий, которые использовались при производстве лизата.
Все лизаты бактерий поливалентны, то есть содержат несколько штаммов микроорганизмов. Как правило, это патогены, которые чаще всего вызывают инфекции.
Каждый штамм бактерий культивируется in vitro, инактивируется и лизируется либо химически, либо механически, а затем проходит лиофилизацию — «холодную сушку». После этого полученные лизаты смешивают в определенных пропорциях [1].
Всё не так однозначно
В 2017 году итальянские ученые проанализировали 170 посвященных лизатам статей в Pubmed — крупнейшей англоязычной текстовой базе медицинских и биологических публикаций. Они сделали вывод, что многие свойства и особенности действия препаратов этой группы еще недостаточно изучены, а качество самих исследований не является удовлетворительным. По мнению авторов анализа, чтобы более полно изучить возможности лизатов, необходимо проводить дальнейшие исследования хорошего качества [2].
Таким образом, эффективность бактериальных лизатов нельзя назвать очевидной с точки зрения доказательной медицины.
Тем не менее, их назначают для стимуляции иммунного ответа при различных заболеваниях, в том числе в урологии (при хроническом цистите), гинекологии (для восстановления микрофлоры) и пульмонологии (для профилактики обострений ХОБЛ). Но наибольшую популярность бактериальные лизаты приобрели как препараты для лечения и профилактики инфекций дыхтельных путей.
Основная гипотеза, объясняющая механизм действия лизатов, предполагает усиление иммунного ответа за счет стимуляции клеточного и гуморального звена. Считается, что влияние лизатов на организм физиологичное, поскольку они естественным образом стимулируют собственные реакции на антиген и проявляют комплексный иммунотропный эффект [4]:
Местные лизаты при попадании на слизистую оболочку верхних дыхательных путей образуют тонкий защитный слой. В основе их действия лежит усиление синтеза IgА и снижение выработки IgE, с которым сопряжена гиперчувствительность и аллергизация [5]. При этом местные препараты, так же как и системные, действуют на факторы специфического и неспецифического иммунитета.
Рекомендуем топические лизаты
Топические бактериальные лизаты относятся к ОТС-группе. Их ассортимент включает всего 2 лекарственных препарата, существенно отличающихся и по составу, и по показаниям.
Комплексный препарат бактериальных лизатов «ИРС 19»
Смесь лизатов, входящая в состав «ИРС 19», применяется в форме интраназального спрея в 35 странах мира [5]. Препарат содержит комбинацию лизатов наиболее распространенных возбудителей бактериальных инфекций респираторного тракта, в том числе пневмонийных стрептококков, гемофильной палочки, золотистых стафилококков, моракселл, энтерококков и некоторых других.
Интересно, что состав препарата периодически обновляется и изменяется с учетом преобладания основных возбудителей заболеваний ЛОР-органов и дыхательных путей [5].
«ИРС 19» может использоваться при острых и хронических заболеваниях, а также как средство для профилактики инфекций и в период восстановления после уже перенесенного заболевания.
Лекарство используют интраназально, доза и курс зависят от цели (профилактика или лечение) и возраста больного.
На что обратить внимание клиента?
В начале лечения могут появиться чихание и усилиться выделения из носа. Обычно этот эффект носит кратковременный характер. Если реакция принимает тяжелое течение, рекомендуют уменьшить кратность введения препарата или вовсе отменить его [6].
«Имудон»
Препарат представляет собой смесь лизатов бактерий, которые чаще всего вызывают воспалительные процессы в полости рта и глотки, в том числе нескольких штаммов лактобактерий, золотистого стафилококка, кишечной палочки, клебсиеллы, а также грибов рода кандида.
«Имудон» используют для лечения взрослых и детей старше 3 лет. Доза и курс лечения зависят от показаний и возраста. Таблетки рассасывают во рту, не разжевывая.
На что обратить внимание клиента?
В течение часа после приема препарата не следует принимать пищу и пить воду [7].
Системные лизаты: работа изнутри
Системные бактериальные лизаты, по мнению некоторых специалистов, более активны, чем локальные, поскольку обеспечивают более длительный и прочный контакт со слизистыми оболочками (не смываются слюной) [8]. Единственным ОТС-представителем этой группы на сегодня является препарат «Исмиген».
«Исмиген»
«Исмиген» представляет собой бактериальный лизат, полученный механическим способом и обладающий высокой иммуногенностью [9]. Средство содержит 14 штаммов 8 видов инактивированных патогенных бактерий, наиболее распространенных возбудителей инфекций верхних и нижних дыхательных путей, в том числе золотистого стафилококка, пиогенного стрептококка, пневмонийного стрептококка, клебсиеллы, гемофильной палочки, моракселлы и других. Его кардинальное отличие от других системных лизатов — сублингвальный (подъязычный) путь введения.
Препарат достаточно изучен: данные 15 рандомизированных исследований с участием более 2500 пациентов подтверждают, что прием «Исмигена» позволяет сократить число респираторных инфекций по сравнению с плацебо у детей и взрослых [9].
Препарат применяют для лечения и профилактики инфекций у взрослых и детей старше 3 лет. Дозировка при лечении и профилактике одинакова — 1 таблетка в сутки. Курс лечения длится не менее 10 дней, курс профилактики — три цикла по 10 дней с 20‑дневными интервалами [10].
На что обратить внимание клиента?
Подъязычные таблетки принимают натощак. Их держат под языком до полного растворения, не рассасывая и не разжевывая.
«Бронхо-мунал», «Бронхо-ваксом»
Под торговыми названиями «Бронхо-мунал» и «Бронхо-ваксом» выпускается рецептурный системный химический бактериальный лизат ОМ-85. Он содержит лизаты 21 штамма 8 бактерий, которые наиболее часто вызывают острые респираторные бактериальные инфекции. Среди них — лизаты пневмонийного и пиогенного стрептококка, клебсиеллы, золотистого стафилококка и другие. Некоторые специалисты полагают, что химический лизат менее предпочтителен, чем механический, поскольку химический лизис происходит с применением щелочи. Это может приводить к денатурации белков и, как следствие, антигенов, что, в свою очередь, может привести к снижению иммуногенности [1].
Эффективность и переносимость ОМ-85 изучалась более чем в 300 научных работах, 40 из которых были рандомизированными контролируемыми исследованиями [11]. Их итоги подтвердили, что лечение ОМ-85 помогает предупреждать развитие различных инфекций дыхательных путей у взрослых и детей старше 6 месяцев.
ОМ-85 применяют во взрослой и детской практике по 1 капсуле в сутки и для лечения, и для профилактики инфекционных заболеваний. Доза для детей 6 мес. — 12 лет — 3,5 мг в сутки, для взрослых и детей старше 12 лет — 7 мг в сутки. Длительность лечения — не менее 10 дней, профилактики — 3 курса по 10 дней каждый с промежутком 20 дней между ними [12].
На что обратить внимание клиента?
Препарат следует принимать утром, натощак. Детям, которым сложно проглотить капсулу, можно смешивать ее содержимое с чаем, молоком, соком.
Нашли ошибку? Выделите текст и нажмите Ctrl+Enter.
Лизис клеток что это
При применении методик идентификации хемолитотрофных организмов с использованием разновидностей полимеразной цепной реакции особенно остро встаёт вопрос о методах выделения и очистки бактериальной хромосомной ДНК. Ещё более важным он становится при использовании разновидностей ПЦР, в ходе которых проводится количественный анализ (ПЦР в реальном времени и т.д.). Наличие нелизированных клеток вносит в той или иной мере существенные погрешности в результаты количественного анализа и в ряде случаев может привести к недостоверным результатам.
Некоторые методы выделения ДНК могут вносить искажение в результат количественного анализа за счёт неэффективного лизиса клеток, сорбции ДНК на частичках грунта, наличия в препарате ферментативных и других ингибиторов, а также потери ДНК или нарушения ее структуры. Кроме того, качество препарата оказывает влияние на достоверность анализа, основанного на методах прямого определения нуклеотидной последовательности (секвенирования) и клонирования, широко применяемых при изучении структуры сообществ [1, 2].
Существует множество способов воздействия на клетки с целью их разрушения и последующей очистки содержащихся в них нуклеиновых кислот: химический, физический и ферментативный. К самым распространенным физическим способам относятся обработка ультразвуком, нагревание, механическое перетирание и разрушение клеточной стенки методом замораживания/оттаивания [3]. Химические способы разрушения клеток основаны на лизирующей активности некоторых солей и детергентов. И, наконец, к третьему распространенному способу воздействий относятся ферментативные подходы, использующие активность протеолитических ферментов (лизоцима и протеиназы К). Следует отметить, что наиболее распространенные методы выделения ДНК практически всегда представляют собой комплексный подход, включающий несколько этапов пробоподготовки.
В связи с этим целью работы стала апробация нескольких способов выделения ДНК и выбор метода, наиболее подходящего для анализа накопительных культур сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов. Получаемая смесь нуклеиновых кислот должна быть репрезентативной и, по возможности, сохранять количественное соотношение копий геномов каждого вида, входящего в состав пробы. Выполнение последнего условия необходимо для проведения точного количественного анализа сообществ.
Основной проблемой, которая должна была быть учтена при выборе методики выделения бактериальной ДНК, является неоднородность свойств данных микроорганизмов, среди которых особенно следует выделить свойства их клеточных стенок. Как известно, лизис грамположительных бактерий и архей (сходных по строению клеточной стенки с грамположительными эубактериями) осуществить гораздо сложнее по сравнению с лизисом грамотрицательных бактерий. А поскольку среди исследуемых микроорганизмов присутствуют представители всех вышеупомянутых групп, остро встаёт задача выбора универсальной методики выделения ДНК.
Для выделения ДНК (РНК) из клеток их необходимо предварительно лизировать. Пробоподготовка проводится также для удаления из полученного материала ингибиторов Taq-полимеразы (белковых примесей и др.) и различных РНКаз. Обработка проб проводится в микроцентрифужных пробирках типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. Время обработки в зависимости от метода доходит до 3–4 ч.
На данный момент существует целый ряд методов для выделения ДНК из клеток. Анализ методик выделения ДНК наиболее целесообразно проводить среди методов, используемых с этой целью в практике клинического молекулярно-биологического анализа, поскольку большинство этих методов имеют относительно универсальный характер.
Следует отметить также достаточно низкий уровень освещённости подобных методов в русскоязычной литературе. По-видимому, это связано с тем, что большинство лабораторий используют для выделения и очистки ДНК заводские наборы, при работе с которыми используются приписанные к ним протоколы.
Целью данной работы является анализ существующих методик выделения ДНК и выявление наиболее приемлемых из них для выделения хромосомного генетического материала из хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов, принадлежащих к родам Acidithiobacillus, Sulfobacillus и Ferroplasma.
Приведем небольшой обзор методов выделения ДНК, используемых в клинической и лабораторно-диагностической практике, и анализ возможностей их применения.
Метод выделения ДНК одношаговый с использованием «Tri reagent». Проба смешивается с 500 мкл 0,9 % раствора хлорида натрия и центрифугируется при 5000 об/мин в течение 10 мин дважды с заменой супернатанта 0,9 % раствором NaCl. Затем осадок обрабатывают лизирующим раствором – раствор «Tri reagent» фирмы Sigma (США) с добавлением детергентов (рН 8,0) и инкубируют при +95 °С в термостате или кипящей водяной бане в течение 10 мин. Далее центрифугируют для осаждения нелизируемых клеточных структур и капель жидкостей на стенках пробирки. Данный метод рекомендуется для выделения ДНК из клеток, культур клеток и монослойной ткани из цельной крови, плазмы или сыворотки.
Метод выделения ДНК путем термического лизиса в присутствии сорбента. Вместо лизирующего раствора для лизиса клеток применяется высокая температура. В пробу добавляют катиониты, которые связывают белки, и кипятят на водяной бане в течение 5–10 мин. Если в дальнейшем выделенная ДНК будет использована для классической ПЦР, а не для её разновидностей, и при наличии чистых культур, для выделения можно воспользоваться модифицированной методикой – с отсутствием сорбента. Культуральный материал ресуспендируют в 100 мкл ТЕ (10 мМ ТрисHCl ph8.0, 1мм ЭДТА). Затем кипятят на водяной бане в течение 3 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Супернатант можно использовать для ПЦР-амплификации. Основным плюсом этого метода являются его высокая скорость и относительная простота исполнения. А к наиболее значимым недостаткам следует отнести вероятность попадания в выделенный образец примесей, ингибирующих ПЦР.
Метод выделения ДНК с помощью фенольно-спиртовой депротеинизации получил широкое распространение, и его модификации используются в качестве основных способов экстракции ДНК. В пробирки вносят 0,9 мл лизирующего буферного раствора, 22 мл 0,2 М раствора ЭДТА, 2,6 г Тритона X 100 и 40 мкл суспензии сорбента, встряхивают на вортексе и прибавляют 50 мкл исследуемого материала. Встряхивают 5 с, оставляют при комнатной температуре на 15 мин, вновь встряхивают 5 с и центрифугируют 15 с при 12000 об/мин. Супернатант удаляют, осадок сорбента отмывают дважды, сначала отмывающим раствором, а затем 2 раза 70 % этанолом и один раз ацетоном (все промывающие жидкости вносят в пробирку в объеме 0,5 мл). Затем пробирки с открытыми колпачками прогревают в течение 10 мин при 56 °С в микротермостате. К высушенным осадкам добавляют 50–75 мкл элюирующего буфера. Пробирки закрывают крышками и недолго встряхивают на вортексе, инкубируют при 56 °С в течение 10 мин, вновь встряхивают на вортексе и центрифугируют 2 мин при 12000 об/мин. Супернатант содержит ДНК и РНК и пригоден для амплификации.
Выделение ДНК путем гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции. Метод применяется для выделения ДНК, клеточной мРНК, а также вирусных ДНК и РНК. В настоящее время он упрощен благодаря комбинации денатурирующего агента (гуанидинтиоцианата) и фенола в одном растворе. В пробирку «Эппендорф» помещают 3 мкл носителя нуклеиновых кислот. Затем добавляют 900 мкл денатурирующего раствора и через 15 мин – 200 мкл хлороформа. Центрифугируют 12000 об/мин в течение 5 мин. Полученный супернатант переносят в другую пробирку с 700 мкл изопропанола, оставляя растворы на 15 мин при комнатной температуре. Затем пробу центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин, удаляют супернатант и осадок обмывают 0,5 мл 70 % этанола. Центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин и удаляют супернатант. Высушивают полученный осадок, а затем растворяют в 30 мкл буфера для растворения. Оставляют на 15 мин при комнатной температуре, затем перемешивают и центрифугируют 5–10 с. Фирма «Sigma» (США) предложила вместо хлороформа, который является высокотоксичным веществом, использовать 1-бром-З-хлоропропан, не уступающий по своим свойствам, но значительно менее опасный.
Метод экстракции ДНК с использованием набора «DIAtomTM DNA Prep». Данный метод является одним из наиболее эффективных для выделения ДНК с минимальной продолжительностью экстрагирования (25 мин для 4–8 жидких проб), не уступающий, а в ряде случаев и превосходящий зарубежные аналоги и по своим характеристикам предназначенный для выделения ДНК из различных биологических материалов (жидкостей, мелкоизмельченных твердых материалов, пятен крови и т.д.), а также для быстрой очистки ДНК из клинических проб (цельной крови, плазмы, сыворотки, мочи, соскобов слизистой и т.д.).
Принцип действия набора «DIAtom™ DNA Prep» основан на использовании лизирующего агента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для разрушения клеток, а также денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™ сорбенте, затем легко отмывается от солей и белков спиртовым раствором. ДНК, элюированная из сорбента Экстра-Геном™ или чистой водой, может исследоваться различными методами, в том числе с участием разновидностей полимеразной цепной реакции.
Метод выделения ДНК с применением набора «ExtraGene™ DNA Prep». Метод предназначен для быстрого (не более одного часа) выделения ДНК из цельной крови, пятен крови или других биологический жидкостей, из клеточных суспензий. Метод не требует использования фенола с хлороформом и осаждения ДНК этиловым спиртом. Для выделения используется ExtraGene™ смола и протеиназа К. Принцип действия отечественного набора ExtraGene™ DNA основан на использовании смолы (смеси ионообменников) для обессоливания среды сорбции низкомолекулярных пептидов и хелатирования (маскировки) двухзарядных катионов металлов (Mg2+, Mn2+, Са2+ и т.д.) и применении протеиназы К для инактивации нуклеаз и других ингибиторов белковой природы. При этом ДНК остается в супернатанте растворенной и свободной, готовой к использованию непосредственно в амплификационных реакциях без дальнейшей очистки [4].
Метод сорбции на силикагеле предполагает лизис микроорганизмов в концентрированном растворе гуанидинтиоцианата, кроме этого обеспечивается сорбция ДНК или РНК на частицах силикагеля в суспензии. Далее после четырех промывок и центрифугирования суммарная нуклеиновая кислота элюируется с высушенного силикагеля водой или слабосолевым буфером.
Для оценки эффективности методов выделения ДНК из смешанных культур, а также для выбора наиболее удобной и универсальной методики нами были отобраны несколько комбинированных протоколов очистки ДНК основанных на различных типах воздействия на клеточную стенку бактерий. Были проанализированы методики, основанные на механическом (перетирание клеток с частицами SiO2) [5], ферментативном (обработка протеиназой К и лизоцимом) [6], химическом (обработка GuSCN [7] и CTAB) воздействии на клеточные стенки бактерий, а также применена комбинированная методика щелочного лизиса (KOH) в присутствии низкомолекулярного полимера (PEG-200). В выделение во всех случаях брали 500 мкл образца. Перед этапом лизиса пробы промывали фосфатным буфером (pH 1,8) два раза. После каждой промывки клетки и частицы грунта осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут.
При перетирании с частицами SiO2 осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора содержащего 20 % ДДС (100 мM NaCl, 500 мM Tris (pH 8,0), 20 % ДДС), к раствору добавляли 20 мкл раствора частиц SiO2 (0,005 г/л) производства «SigmaAldrich» (США) в ТЕ-буфере. Перемешивали в течение 5–10 мин. После сорбции ДНК частицы осаждали центрифугированием, супернатант удаляли. ДНК элюировали в 100 мкл воды при температуре 60 °C. Ферментативный способ лизиса заключался в ресуспендировании осадка в 500 мкл буфера (100 мM NaCl, 100 мM Tris, 1 мM цитрата натрия, 5 мM CaCl2, 25 мM ЭДТА, pH 8,0). К раствору добавляли 60 мкл лизоцима (0,1 г/л) «Fermentas» (Литва) и инкубировали при температуре 37 °С в течение 40 мин. Добавляли 10 мкл 20 % ДДС, 60 мкл протеиназы К (20 мг/мл) «Fermentas», инкубировали при 50 °С в течение 30 мин. При обработке CTAB осадок ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 М ЭДТА, 2 М NaCl, 2 %-ный СТАВ), инкубировали в течение 30 мин при температуре 65 °С. При обработке KOH осадок ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (10 % ПЭГ – 200, 20 мМ KOH), инкубировали 10 мин при температуре 98 °С.
Модификация методики с гуанидинтиоцианатом заключается в том, что образцы культур объёмом 500 мкл центрифугируют на 13000 об/мин в течение 5 минут, после чего «отмывают» осадок в фосфатном буфере PBS для удаления ингибирующих ПЦР примесей. После подобных процедур выделение ДНК следует производить по стандартному протоколу, несколько отличающемуся от стандартной методики.
К 200 мкл образца культуры добавляем 400 мкл лизирующего раствора (5,25 M GuSCN, 50 мM Tris, pH 6,4, 20 мM ЭДТА, 1,3 % тритон), перемешиваем и термостатируем при 65 °С 30 мин. Добавляем 400 мкл водонасыщенного фенола (pH 7,2), перемешиваем. Добавляем 400 мкл смеси хлороформа и 100 %-ного изоамилового спирта в соотношении 24:1, перемешиваем. Центрифугируем в течение 10 минут при 13000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносим в новую пробирку, добавляем 800 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1, перемешиваем. Центрифугируем в течение 10 минут при 13000 об/мин. Верхнюю фазу переносим в новую пробирку, добавляем 400 мкл изопропанола, перемешиваем. Центрифугируем в течение 5 минут при 13000 об/мин. Удаляем надосадочную жидкость, добавляем 800 мкл 70 %-ного этанола, перемешиваем. Центрифугируем в течение 5 минут при 13000 об/мин. Удаляем надосадочную жидкость, осадок высушиваем в термостате при температуре 55 °С не более 10 минут. Растворяем осадок в 50 мкл ТЕ-буфера путём периодического перемешивания и нагрева при 55 °С.
После этапа лизиса проводили очистку от ингибиторов с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции [8]. После преципитации ДНК растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера.
Рассмотренные нами методики выделения и очистки хромосомной бактериальной ДНК являются относительно универсальными, а значит, могут быть использованы при работе с хемолитотрофными микроорганизмами. При экспериментальном подтверждении выбранные нами методы продемонстрировали значительные отличия в эффективности выделения нуклеиновых кислот из предоставленных накопительных культур. Это может объясняться и различной эффективностью очистки от ингибиторов, и комплексным составом исследованных образцов [9].
Наилучший результат получен для методики, основанной на лизирующей активности GuSCN. Сходный по эффективности результат был получен для ферментативной методики, однако в данном случае на результат оказали влияние остатки бактериальных нуклеиновых кислот, содержащиеся в реагентах, использованных при выделении ДНК. Использование ферментов при выделении ДНК приводит к значительному сдвигу кривой контроля выделения.
Показана низкая эффективность методик, основанных на лизирующей активности бромида цетилтриметиламмония (CTAB) и на физическом воздействии на клетки с помощью частиц SiO2. Для методики, основанной на лизирующей активности KOH, в присутствии PEG-200, получен средний результат, однако ее принципиальным недостатком является низкая степень очистки препарата ДНК от ингибиторов, в частности ионов железа, содержащихся в некоторых культуральных средах. В то же время этот метод показал лучший результат для проб, содержащих микроорганизмы, не окисляющие железо.
Полученные результаты позволяют рекомендовать для проведения молекулярного анализа структуры сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов методику, основанную на лизирующей активности GuSCN с последующей очисткой фенолом и хлороформом, поскольку данная методика является апробированной на культурах хемолитотрофных микроорганизмов, достаточно освещена в литературе и может осуществляться при помощи стандартных наборов для выделения ДНК. Данная методика может быть использована для самых различных разновидностей ПЦР, в том числе и для количественной real-time ПЦР [10]. Она может быть реализована при использовании набора «Проба-НК» производства НПО «ДНК-Технология». Однако из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется высокая степень аккуратности, т.к. возможна перекрёстная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК [11].
К числу рекомендуемых следует отнести также метод выделения ДНК путем ферментативного лизиса. При эффективном апробировании данного метода на практике его можно отнести к числу пригодных и рекомендуемых для выделения хромосомной бактериальной ДНК хемолитотрофных микроорганизмов, принадлежащих к родам Acidithiobacillus, Sulfobacillus и Ferroplasma.